藍綠菌(Cyanobacteria)是地球上廣泛存在的微生物之一，能夠利用以光合作用合成自身所需養分，屬於自營生物。而帶有葉綠素或葉綠體的自營生物，能經由複雜的代謝過程固定大氣中的二氧化碳，將光能轉化為化學能，提供後續生理各階段所需能量。微生物的代謝途徑十分複雜，琥珀酸(succinate)便是其中一項重要的中間產物；此外，琥珀酸也是現今石化工業經常使用的原料之一，可從石油或微生物轉化而得，藍綠菌可經由代謝過程將二氧化碳轉化為琥珀酸，若是深入探討此細菌合成琥珀酸之機制，將有助於微生物協助工業製造的發展。 　　日本神戶大學(Kobe University)發現實驗室中常使用的藍綠菌Synechocystis sp. PCC 6803於攝氏30至37度間，隨著環境溫度上升，代謝途中重要的有機酸產物也會跟著增加。經過分析，確認磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate Carboxylase，PEPC)參與的代謝過程中重要的速率決定步驟，因此使用基因工程技術改變了藍綠藻Synechocystis sp. PCC 6803，將其生產琥珀酸的速率提高至先前研究報告中的7.5倍。【延伸閱讀】燻蒸劑對土壤健康方面的最新研究 　　此系列研究有助於人類進行微生物碳代謝途徑之基礎研究探討，未來或許也可應用於商業化微生物之固碳速率提升。相關研究發表於<Metabolic Engineering>

3D列印技術是快速成型技術的一種，透過電腦建模、分區設計截面，再經由3D列印機逐層製作。最常使用在3D列印的原料便是塑膠聚合物，然而大部分的塑膠聚合物雖具備良好的熱塑性與強韌性，卻不易受到生物降解，產品於未來可能成為環境汙染一部分。而纖維素(cellulose)是世界上最豐富的有機化合物和工業副產物，不但取得方便，也容易經由生物分解而回歸自然；但對3D列印技術而言，纖維素並非容易處理與使用的素材，不但生產成本高，延伸性也不如金屬和塑膠材質好，因此不易利用3D列印製作大型物體。 　　新加坡科技設計大學(Singapore University of Technology and Design，SUTD)從卵菌細胞壁中獲得靈感，利用水溶解幾丁質(chitin)，再將其滲透進纖維素結構中，製作出類真菌黏合材料(fungal-like adhesive materials，FLAM)。不但具有良好的延展性、重量輕且成本低廉等特性，且製造期間不需使用有機溶劑或合成塑膠，產品也能在自然情況下進行生物降解，維護環境永續性。 　　FLAM的製作成本大約2美元/公斤，比起成本介於20-30美元/公斤的PLA和ABS更具效益，除了進行3D列印以外，也能利用一般的木工技術進行塑形與切割，剩餘的廢棄材料更可投入堆肥中回歸環境。因此研究人員認為FLAM是一種適合未來社會的材料，將促進製造業提升至更加友善環境的層級。【延伸閱讀】利用青芒果皮解決油污泥問題 　　相關研究發表於<Scientific Reports>

苦味是動物長期以來演化的味覺感受之一，通常也是最敏銳的一種，苦味的來源並非由單一化學物質所引起，主要含有苦味的兩類化合物為長碳鏈有機化合物與生物鹼。苦味通常也與危險訊號連結，例如某些生物鹼的致死劑量極低，食用過量將對動物健康形成危害，故苦味在某種程度上也是保護動物免於傷害的防護線。然而，部分對人體有益的食物或食品也含有苦味，因此食品和製藥行業一直在尋找減少或消除苦味的方法，增加這些食物或藥物的適口性。 　　生物活性肽泛稱一類分子量小於6000Da(Dalton)的小分子蛋白質，因其組成的胺基酸種類與排序不同而形成多樣結構。其中由牛肉蛋白質分解成的生物活性肽可以阻絕舌頭上的苦味受體，具有可添加在於其他食物或是藥物當中的潛力。人體中能偵測苦味的受體至少有25種，這些受體屬於味覺家族蛋白中的第二型（T2R），然而到目前為止，只有少數T2R活性抑製劑被發現。【延伸閱讀】科技始終來自「牛」性 機器人擠牛乳產量增加15% 　　加拿大曼尼托巴大學(University of Manitoba)的研究人員則使用六種不同的酵素，包含鹼性蛋白酶(alcalase)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、胰蛋白酶(trypsin)、胃蛋白酶(pepsin)、風味酶(flavourzyme)和耐熱蛋白酶(thermoase)，分解牛肉蛋白產物，再利用電子舌偵測這些產物降低奎寧苦味的效果，發現用胰蛋白酶和胃蛋白酶分解後的產物降低奎寧苦味的效果最好。此外，於HEK293T細胞中添加鹼性蛋白酶與胰凝乳蛋白酶的水解產物也可以減少T2R4苦味受體釋放鈣訊號，且這些阻斷苦味訊號的效果與多肽的結構長短相關，此發現未來或許可應用於食品或藥物添加之用途。 　　相關研究發表於ACS的<Journal of Agricultural and Food Chemistry>

燃料電池(Fuel cell)是一種透過氧化還原反應，將氧化燃料產生的化學能轉化成電能的裝置，可供給於工業或交通工具等用電需求。常見的燃料包含甲烷、氫氣、醇類等，透過劇烈的氧化反應後會產生水、二氧化碳與部分熱能，由於燃料電池對環境的汙染比起化石燃料更低，因此被視為是綠色能源的一種。 　　木質素(lignin)是構成樹木細胞壁重要的有機聚合物之一，具有極高的硬度，在纖維素(cellulose)的黏合下支撐整棵植物的重量。然而，木漿中的纖維素是造紙工業中不可或缺的主要材料，木質素的存在卻反而容易指紙張脆化，因此在造紙過程中木質素便被溶解於硫酸鹽或亞硫酸鹽溶液中排除。一棵樹約含有25%的木質素，若能經過適當方式再度利用，則更有利於環境永續。木質素由豐富的烴鏈所構成，經過分解可產生大量的苯二酚(benzenediol)，其中兒茶酚占約7%，瑞典林雪坪大學(Linköping University)認為此類分子是一種可用於燃料電池的替代燃料，因而積極開發利用將其製成燃料電池的方式。【延伸閱讀】將廢水副產物轉化為永續綠色燃料 　　一般而言，燃料電池常使用鉑作為電極以吸引電子，但鉑為貴重金屬，不但單價高，且不適用於屬於芳香族的兒茶酚燃料電池中，因此該團隊使用導電聚合物PEDOT：PSS (poly(3,4-ethylenedioxythiophene) polystyrene sulfonate)製成適用於兒茶酚的電極與催化劑；根據估算，兒茶酚燃料電池的發電量與現有的甲醇或乙醇燃料電池大致相同。雖然兒茶酚燃料電池未來仍需經過改良才能有效使用在各項需電設施上，但此研究提供了木質素加值利用的新方向，幫助人們更完全利用林木資源。 　　相關研究由Digital Cellulose Center (DCC)支持，結果發表於<Advanced Sustainable Systems>。

全球人口數量至今仍在持續增加，據聯合國統計，至西元2050年時全球人口預計將超過90億，屆時糧食需求將增加六成以上。然而目前儘管耕作方式不斷改進，但農作物產量增加速度並無法跟上糧食需求的增長。此外，氣候變遷、環境汙染、土地與水資源耗損等因素也持續威脅著糧食安全，因此發展改變食物生產的突破性技術刻不容緩。 　　未來預計80%的人將聚集於城市地區，如何在空間、資源與能源的限制下應付高密度人口的糧食所需是學者專家們正在努力研究的方向，「垂直農業」的出現提供未來糧食生產的新方向。垂直農業藉由精準的偵測與環控技術，創造適合作物生長的理想環境，屏除天然氣候的不確定因素與病蟲害侵擾之風險，日本、荷蘭、新加坡與美國等地均已出現相關的商業化工廠；預計至2024年，垂直農場市場將到達130億美元。【延伸閱讀】能偵測土壤水分多寡的作物灌溉感測器將能達到省水之效 　　除了營養、需水量、溫溼度控制外，二氧化碳濃度也是影響作物生長與光合作用速率重要的影響因素，適當的濃度可以幫助節省作物用水量與增進生長速度。英國Edinburgh Sensors公司推出了氣體感測器-GasBoxNG，此儀器使用NIDR (non-dispersive infrared) gas sensors進行偵測，當紅外光通過含有二氧化碳的空氣管時，部分光線會被吸收，而機器可以光線通過差異推算二氧化碳濃度。使用在垂直農場中可即時監測二氧化碳濃度，並搭配自動化控制系統持續維持適合作物生長的二氧化碳濃度。另外，此儀器也能應用於厭氧發酵時的通氣量監測與植物生理狀態觀察，並將資訊傳輸於電腦或智慧型平板中。

植物育種技術之演進 談新興基因編輯技術CRISPR/Cas9 於農業之應用 孟孟孝 教授 國立中興大學  生物科技學研究所   　　對農糧作物進行育種和對禽畜進行馴養一直是人類文明演進過程中的重頭大戲。數千年來老祖宗們所採用的作物育種方法依賴的是植物的自發性突變，從自然界中挑選出具有特殊表徵的變異植株，再透過反覆的雜交與回交，篩選出具有特定農園藝性狀的作物。而產量高、風味佳、抗病強、或栽種易等都是向來受到青睞的性狀特徵。這種延續千年的手法我們一般稱呼為傳統育種法(Conventional breeding）。雖然這種方法的效率極低，但是如果把時間維度放大到百年、千年，那還是可以產生可觀的效果。例如原生種的玉米和哥倫布發現美洲時的玉米在外觀上已經有了令人瞠目結舌的差異。 　　在約莫一百年前育種的方法有了新的工具。隨著科技的進展，育種專家開始採用游離輻射（例如：γ射線、X射線）或是化學誘變劑(例如甲基磺酸乙酯、硫酸二甲酯）對作物種子進行遺傳物質的逢機突變。這套方法可以得到大量的作物變異體，作為與栽培種雜交的樣本，使得育種專家不再只能靠著罕見的自然變異植株進行育種工作。這種方法一般稱呼為突變育種法(Mutation breeding）。許多現行栽種的農園藝作物就是靠著這種方法得到農園藝性狀的提升或改變。透過突變育種法所得到的農糧作物對人體健康而言，基本上是安全的，但也可能產生小插曲，對少部分的人有礙。由於喜愛麵包的彈性口感，在過去的一個世紀間，主要的小麥栽培種(Bread wheat）的麥麩含量不斷增加。而麥麩中的麥膠蛋白質(Gliadin)在經過胃蛋白酶的切解後會產生出過敏性胜肽，引發部分攝食人口的腸道免疫反應，造成乳糜瀉疾病(Celiac disease）這樣的人口比例在西方人口中約占一個百分點，這也是近年來流行無麩質食品的主要原因。 　　動植物育種的方法在西元1970後再一次獲得了犀利的工具。藉由分子生物學的進展和基因工程技術的開發，這一次育種專家可以依照主觀的意願在不同的物種之間進行基因轉移工作。以農園藝作物為例，具有基因工程執行能力的專家可以藉由農桿菌(Agrobacterium tumefaciens ）對植物組織的感染能力、或基因槍的高壓氣體推動力，將一段來自其他物種的目標基因(稱作轉基因）插入受贈作物的基因組中。再透過組培苗的培養與子代性狀的選拔，得到穩定攜帶轉基因的後代植株，因此這些植株歸類為基因改造生物(Genetically modified organism，簡稱基改作物、或GMO）。由於操作技術的因素，基改作物必然帶有轉基因和來自其他物種的核酸片段(例如胡瓜嵌紋病毒的 35S 轉錄啟動子、農桿菌 T-DNA 遺留痕跡、篩選標記基因等）；另外一項特徵就是轉基因在受贈植物染色體上的插入位點是逢機的，因此基改行為可能導致一些非預期的遺傳效應。  　　根據所設定的育種目標，轉基因可以來自任何的植物、動物、或微生物，藉此賦予基改作物新型態的性狀特徵。基改的目的也可以是調整受贈作物本身某一項基因的表現強度或表現模式。在商業化的基改作物中，最常見的轉基因有來自蘇力菌(Bacillus thuringiensis）的毒蛋白(Cry）基因和來自農桿菌的EPSPS酵素基因，前者賦予基改作物抵抗蟲害的能力(特別是針對鱗翅目和鞘翅目昆蟲之幼蟲），後者賦予基改作物耐受殺草劑嘉磷賽(Glyphosate）的能力。除此之外，其他的轉基因則賦予基改作物抵抗病毒、延遲後熟、或提昇營養價值等特性。基改作物在商業化上已取得很大的成功，例如基改玉米、黃豆、棉花、甜菜、和油菜在美國的栽種面積百分比皆已達到九成以上。除了農園藝作物外，基改鮭魚也已取得美國與加拿大政府的核准，2017 年開始販售。相對於一般鮭魚，基改鮭魚長得快，養殖時間可以縮短約一半。  　　針對基改作物可能對人體健康和環境產生不利影響的疑慮，美國國家科學、工程、醫學院（National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine）在2016年曾經發表過一份評估報告，指出在長達20年的研究成果中並沒有證據顯示基改作物會對人體健康造成負面影響。部分證據甚至顯示基改作物有益於人體健康，例如在種植抗蟲基改作物時減少了殺蟲劑的使用量。即便如此，消費者(特別是歐盟地區的消費者）普遍對基改作物心存疑慮，反對基改作物基本上已經是一種社會風潮。也由於這種社會輿論風潮，各國政府對基改作物的栽培與販售皆訂有嚴格的審核與管理規定。以美國為例，一項基改作物的種子要在市場上販售平均耗時13年，花用的經費約在1億3千萬美元左右。而這也間接導致小型農業生技公司紛紛放棄基改作物的研發，使得基改作物的市場幾乎被超大型農業(種籽）公司所壟斷。  　　隨著次世代基因定序技術的推陳出新，重要的農園藝作物的基因組核酸序列已經陸續解開。有了全基因組資訊，育種科學家就開始思索精確的靶位突變的可行性。真核細胞對斷裂的雙股 DNA 普遍存在著兩套修補機轉，發生頻率較高的一種稱作非同源性端點黏接修復機轉(non-homologous end-joining repair mechanism，簡稱NHEJ），另外一種稱作同源導引修復機轉(homologous-directed repair mechanism，簡稱HDR）(圖一）。透過NHEJ修復後之DNA在接續點常出現核苷酸殘基刪減或插入式的突變現象(Indel mutations），導致原本的基因轉譯架構(open reading frame）出現錯誤讀軌(reading frame shifting），因此無法轉譯出正確的蛋白質胺基酸序列。如果雙股DNA斷裂點附近存在著另一段具有同源相似性的DNA片段，那也有機會透過HDR對損傷的DNA進行修復。這項修復機制可能造成同源DNA片段的精準置換或大片段DNA的刪除。所以科學家要作的干預行為就是在選定的目標基因位創造出斷裂點，接下來由細胞去完成後續的修補動作，進而產生精確的靶位突變。由於這樣的突變方法在作物的基因組上可以做到不帶有來自其他物種的轉基因或核酸片段，因此又稱基因編輯(Gene editing）。美國農業部(USDA）認為基因編輯作物在本質上不等同於基因改造作物，因此無須接受基改作物相關法規的審查與管理。這項見解極度鼓勵了科學家與農業生技公司投入基因編輯作物的研發工作。    　　科學家至今發明了三種實用的方法用來在染色體的特定位點上創造出斷裂口(圖二）。首先發展出來的是鋅指核酸酶(Zinc-finger nucleases，簡稱ZFNs）。ZFNs是人工改造的限制酶，蛋白質結構上有兩個區間。N端是一串鋅指結構(每個單元約含30個胺基酸），每一個鋅指結構上設計有對應性的胺基酸殘基，用來結合DNA靶位上特定的核苷酸殘基。一個鋅指結構可以辨識三個連續的核苷酸，因此五個成串的鋅指結構就能辨識十五個核苷酸殘基序列。C端則是源自限制酶FokI的非專一性核酸水解酶。透過串聯在一起的鋅指結構對特定核酸序列的結合，可以將FokI改變成專一性的核酸水解酶。由於 FokI形成雙體時才有活性，因此要在一個靶位基因上造成一個雙股DNA的斷裂口，就需要分別針對斷裂口的上游以及下游的對應股核酸序列設計出對應性的 ZFN。成對的 ZFNs 同時作用，就可以利用 FokI 的水解酶活性產生切口。  　　利用設計過的蛋白質結構單元來辨識特定核酸序列的另一項技術是類轉錄激活因子效應物核酸酶 (Transcription activator-like effector nucleases，簡稱TALENs）。如同ZFNs般，TALENs 也是一種人工改造過的限制酶，用來辨識特定的DNA序列，並在其上造成切口。說明TALENs之前，先簡單介紹黃單孢菌屬的細菌(Xanthomonas sp.)。這項菌屬的成員是常見的植物病原菌，能利用第三型分泌系統之奈米級針筒狀器械將致病相關效應物質(Effectors)導入寄主的細胞內，最終引發疾病症狀。有一類的效應物質具有DNA結合能力，會激活特定基因的轉錄活動，因此稱作類轉錄激活因子效應物(TALEs)。TALEs通常含有多個重複單元，每一個單元有33~34個胺基酸殘基，其中第12~13個位置上的胺基酸種類是不固定的。在這兩個位置上的不同胺基酸組合決定了所辨識的核苷酸殘基種類，例如，組胺酸/天門冬胺酸(His/Asp)辨識胞嘧啶(C)、天冬酰胺/異亮胺酸(Asn/Ile)辨識腺嘌呤(A)、天冬酰胺/甘胺酸(Asn/Gly)辨識胸腺嘧啶(T)、而天冬酰胺/天冬酰胺(Asn/Asn)則對應鳥嘌呤或腺嘌呤(G or A)。一個由 16 個重複單元組合成的TALE就可以依照各個單元的差異性設計而辨識DNA上特定的 16 個核苷酸序列。TALEN就是由N端的TALE和C端的FokI組成，透過對TALE 重複單元的設計，可以賦予 FokI 對 DNA 上特定核酸序列的水解能力。TALENs 也是成對作用，一個辨識切口上游的核酸序列，另一個辨識下游對應股的核酸序列。雖然有了ZFNs和TALENs這兩項工具，但基因編輯仍未蔚為風潮。原因之一是蛋白質結構單元與核苷酸殘基之間並沒有絕對的辨識對應關係，降低精確定位的效率。另外，每一個ZFN或TALEN都要依照靶位基因上的核酸序列作對應性的設計，增加操作的複雜性和成功獲得基因編輯作物的成本。    　　最近十年來有一項基因編輯技術迅速發展，日趨完善，它就是CRISPR/Cas9。CRISPR 是 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats 的簡稱，指的是發現於原核生物中的一串規律間隔的短回文核酸序列叢簇，在重複的回文序列之間夾著序列各異的簡短核酸片段，稱作隔間者(Spacer) (圖三)。不同CRISPR中的隔間者長度有所不同，一般在32~38個鹼基對之間，但也有極長(72個鹼基對)或極短(21個鹼基對)的例子。Cas9是Cas蛋白質家族的一員，來自化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)，在分類上屬於第二型。Cas是CRISPR關聯性蛋白質(CRISPR-associated protein)的簡稱。在染色體輿圖上，Cas的編碼基因群就坐落在CRISPR的臨近位置。在功能上，Cas是核酸酶，與CRISPR序列叢簇中多樣性隔間者的組建和後續標的基因的水解有關。CRISPR於1987年首度在大腸桿菌的基因組中被發現，當時並不知道它的存在意義。隨著微生物基因組定序的普及化，到2000年左右已經發現許多細菌(~40%)和古生菌(~90%)的基因組中存在著相仿的CRISPR家族。而CRISPR的生理功能和其作用機轉在2005~2010年之間得到釐清，它是原核生物適應性免疫反應的執行者。 　　當菌體族群受到病毒(或稱嗜菌體)感染時，少數倖存下來的個體會利用由Cas所組成的蛋白質複合體將一小段病毒DNA切割下來，再嵌入CRISPR近端(靠近轉錄啟動子的一端)的回文序列之間，成為CRISPR結構中的一個新加入的隔間者。所以CRISPR的結構組成也反應出該原核細胞族系受到各式病毒入侵的歷史紀錄。越靠近啟動子的隔間者來自越近期入侵的病毒；相反的，越遠端的隔間者代表著一個時間越久遠的感染事件。隔間者的選擇並不是逢機反應，它的下游必須緊臨一個稱作原隔間者緊鄰基圖(Proto-spacer adjacent motif，簡稱 PAM)的序列。以化膿性鏈球菌為例，它的PAM是NGG三核酸苷序列。透過常態性的轉錄活動，菌體會以CRISPR為模板，產生相對應的RNA，稱作 Pre-crRNA。Pre-crRNA再被由Cas所組成的蛋白質複合體切割，產生許多小片段的 crRNAs。每一個crRNA是由一個隔間者及其側邊的回文序列組成。當該菌體再次受到之前曾經入侵的病毒的感染時，由Cas以及crRNA 組成的[Cas-crRNA]複合體透過crRNA的導引，利用crRNA和標的DNA之間的核苷酸配對關係，找到病毒基因體中與crRNA相同(但U改為T)且下游緊鄰PAM的序列。這時複合體中的Cas 蛋白質就發揮其核酸酶的功能，在病毒基因體的這個位點上進行切割，消滅入侵之病毒。透過前次感染的印記，消除再次的感染，這就是細菌版的適應性免疫反應。除了防禦病毒的感染外，由CRISPR/Cas所組成的防禦網對通過接合作用(Conjugation)而進入細胞內的外源性質體也有清除效果。在防禦功能上CRISPR/Cas 和真核生物中用來降低病毒感染的RNA干擾機制(RNA interference，簡稱RNAi)有點相似。但是兩者在作用機轉、水解對象上不同。CRISPR/Cas主要針對雙股DNA分子，而RNAi的對象是mRNA分子。 　　根據Cas執行功能時的分子組織狀況，可將各種Cas蛋白質分作六型。Cas9屬於第二型，它的特徵是單分子獨立作業(無需其它Cas蛋白質的合作)，只要與crRNA 和另外一段獨自轉錄出來的RNA分子(RNA trans-activating crRNA，簡稱tracrRNA)組成[Cas9-crRNA-tracrRNA]複合體就能針對目標DNA進行水解。在這個複合體中，tracrRNA的5’端和crRNA的3’端回文序列配對，形成一個局部的雙股RNA結構。由於 tracrRNA是固定的序列，因此可以將依照靶位序列而設計的crRNA和既有序列的tracrRNA銜接成一條導引RNA (guide RNA，簡稱gRNA)。Cas9與gRNA 結合後，其中的gRNA會引導Cas9專一的辨識靶位 DNA。Cas9分子上有兩個核酸酶活性區，一個是位於 N 端的RuvC-like nuclease，另一個是位於中間區段的HNH-like nuclease。抓住靶位DNA 後，這兩個核酸酶活性就會對DNA進行水解，產生雙股DNA的斷裂 (圖二)。另外，Cas9如果混合以多個不同靶向的gRNAs，哪也可以在一個細胞內同時執行多個靶位點的突變。扼要總結，透過人為的設計與操作，[Cas9-gRNA]複合體可以對各種原核和真核生物進行特定DNA位點的斷裂。由於gRNA的製備相對於ZFN或TALEN的製備來的簡潔許多，產生雙股DNA斷裂的效率也比較高，因此 CRISPR/Cas9就取代了ZFNs或TALENs，成為基因編輯的新寵工具。很快的這項技術就廣泛的應用到疾病治療與植物育種上。  　　利用CRISPR/Cas9技術研發基因編輯植物時有幾種作法。推薦的一種方法是先利用大腸菌生產Cas9，並將其純化。同時利用體外轉錄系統(in vitro transcription)生產設計過的、具有特定序列的gRNA。將兩者在試管中混合，製 備出[Cas9-gRNA]複合體，再將其裹在奈米金粒子表面，利用基因槍的推動力把[Cas9-gRNA-奈米金粒子]送入植物之癒傷組織。或者，利用植物原生質體轉染(Protoplast transfection)技術，藉由聚乙二醇(Polyethylene glycol，簡稱PEG)的媒介將[Cas9-gRNA]複合體送入原生質體內。在植物細胞核內[Cas9-gRNA]複合體能夠專一性的辨識出靶位DNA，並在靶位DNA上創造出斷裂口，再藉由NHEJ修補機制在靶位DNA上創造出刪減或插入式的突變。接下來誘導癒傷組織進行分化，或誘導原生質體細胞壁重生以及組織分化。待長成再生植株後，以PCR確認靶位DNA是否已經產生突變。另外，也可以利用HDR修補機制進行精準的靶位DNA置換。作法上要額外製備出一段攜帶著變異核苷酸的靶位DNA，稱之為模板DNA (Template DNA)。將Cas9、gRNA、和模板DNA混合，共同裹在奈米金粒子表面，同樣以基因槍對癒傷組織進行轉形工作，或在聚乙二醇的協助下對原生質體進行轉形工作。在這樣的條件下，HDR修補機制有機會將野生型的靶位 DNA 置換成攜帶突變點的模板DNA。最後再以PCR對再生植株進行突變確認。由於CRISPR/Cas9所主導的突變效率頗高，所以即便不使用抗生素抗性基因作為篩選標記，仍有機會得到目標基因已產生變異的植株。利用CRISPR/Cas9技術進行基因編輯還有一項特點，由於它的高中靶效率，對偶靶位DNA 同時受到突變的機率也不小，因此有機會得到同合子基因突變植株 (Homozygous mutant)。對多倍體的植物進行基因編輯也發現數個相同靶位DNA同時受到突變的情況。通過這樣的方式所得到基因突變植株並不攜帶轉基因或外來物種的核酸片段，所以算是基因編輯植物，而不是基因改造植物。 　　另一種作法乃是沿用開發基改植物時慣常使用的技術，也就是利用農桿菌進行植物細胞轉形的技術。首先將Cas9的表現卡匣和設計好的gRNA表現基因裝載在Ti質體上；接著利用農桿菌感染植物再生組織，將攜帶Cas9和gRNA 基因的重組T-DNA嵌入受贈細胞的染色體中。在受贈細胞中表現出來的Cas9 以及gRNA會組裝成[Cas9-gRNA]複合體，攻擊靶位基因，造成雙股DNA斷裂切口。透過細胞自我的修補機制(主要是NHEJ)，在靶位DNA上產生刪減或插入式的突變。到此步驟所得到的突變植株在基因組中仍含有重組T-DNA，所以仍然屬於基改植物的範疇。接下來讓已經變異的子代植株進行自交，在基因分離篩選過程(Segregation screen)中得到攜帶突變基因但不再擁有重組T-DNA片段的後代植株，這樣的植株在本質上才算是基因編輯植物。  　　鑒於CRISPR/Cas9技術在基因編輯上的強大潛力，自2013年起相關的學術論文(包括原創報告與回顧性文章)每年皆呈現巨幅增長。利用PubMed作文獻搜尋，在 Title/Abstract中同時出現CRISPR和Cas9兩項關鍵字的文獻到2017年為止共有4470篇，同時出現CRISPR、Cas9、和Plant三項關鍵字的文獻到2017年為止則有240篇。針對植物的研究文獻有一大部分是屬於觀念實證(Prove of concept)的研究，利用CRISPR/Cas9的技術去探討目標基因在植物生理上扮演的角色。另外一部分研究則從育種出發，利用CRISPR/Cas9的技術去改善作物的營養價值、提升作物應付生物性或非生物性逆境的能力、或增加作物的產量。因為以育種為目的，這一部分的研究多會以創造基因編輯作物而非基因改造作物為終極目的。以下介紹幾篇原創研究，見證 CRISPR/Cas9在植物育種上的威力。 　　(1)改善營養價值的研究 　　小麥麵粉中的水不溶性蛋白質—特別是麥膠蛋白質(gliadin)中的2-gliadin是造成乳糜瀉的主要過敏原，而小麥栽培種Triticumaestivum的基因組中含有大約100條的2-gliadin編碼基因(含偽基因)。科學家利用CRISPR/Cas9的技術在一株基因編輯小麥品系中刪去了其中35條2-gliadin的編碼基因，使得這款小麥麵粉的過敏反應可以降低85%。馬鈴薯在高溫加工過程(例如油炸薯條)容易產生有毒物質丙烯醯胺，而丙烯醯胺的產生源自於馬鈴薯內的還原糖與天冬酰胺在高溫下產生的梅納反應(Maillard reaction)。育種科學家利用基因編輯技術降低馬鈴薯中酸性轉化酶(Acid invertase)的活性或調降天冬酰胺生合成的酵素活性，培育出較不易累積丙烯醯胺的馬鈴薯品系。也有農業生技公司利用CRISPR/Cas9的技術降低馬鈴薯多酚氧化酶(Polyphenol oxidase)的活性，使得馬鈴薯受到物理性傷害時不易褐化。蘑菇在儲放時容易褐化，所以常利用二氧化硫來漂白，影響消費者的健康。現有科學家利用CRISPR/Cas9 技術將菇體基因組中六個多酚氧化酶基因減少為五個，使得多酚氧化酶活性降低30%，創造出儲放過程不會褐變的蘑菇。植酸(Phytate，又名Inositol hexaphosphate)是玉米種子中磷酸的主要儲存形式，因此作為飼料用途的玉米含有的磷酸量很高。可惜飼養動物腸胃道並不分泌植酸酶，使得飼養動物的排泄物仍然含有高量的植酸，對環境造成嚴重的汙染。科學家利用CRISPR/Cas9刪去玉米基因組中一個Inositol phosphate kinase的編碼基因，降低玉米種子中植酸的含量。使用這款變異玉米所作成的飼料有助於降低動物排泄物對環境的不良衝擊。 　　(2)強化植物抗病能力的研究 　　許多農園藝作物受病原體感染而產生病徵是因為存在著病原體易感基因(Susceptible genes)。這些基因產物可能和病原體的感染或複製有關，或誘使植物產生病徵。透過基因編輯技術刪除或變異特定的易感基因有助於提升作物的抗病能力。由真菌Magnaporthe oryzae引起的稻熱病(Rice blast)是重要的水稻病害，每年對水稻的收成損失可達30%。植物的乙烯應對因子(Ethylene responsive factors，簡稱ERF)是一群受乙烯調解的轉錄活化因子，在水稻中它也是稻熱病的易感因子。科學家利用CRISPR/Cas9技術突變了OsERF922基因，提升水稻對Magnaporthe oryzae的抗性，但不影響水稻的其他農藝性狀。真菌Oidium neolycopersici是造成多種農園藝作物白粉病(Powdery mildrew)的元兇，而Mildew resistant locus O (Mlo)是白粉病的易感基因，此基因的產物是一個膜鑲嵌蛋白質，推估與O. neolycopersici的感染有關。番茄基因組擁有16個Mlo基因，其中SlMlo1與白粉病的感染關係最大。利用CRISPR/Cas9技術刪去SlMlo1 基因的部分核苷酸序列，發現番茄植株對白粉病的抗性顯著提升。柑橘潰瘍病(Citrus Canker)是由Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc)所引起的柑橘類重大疾病。Xcc會分泌一個效應物質PthA4，而PthA4在柑橘細胞核內會結合到易感基因CsLOB1的啟動子區域，活化CsLOB1基因的轉錄活動，進而導致壞疽性潰瘍的產生。利用CRISPR/Cas9技術刪去CsLOB1啟動子中的PthA4辨識結合區，可以有效降低潰瘍病癥的發生。 　　(3)增加產量的研究 　　AGROS8在玉米的乙烯回應路徑中擔任負調控者的角色。在乾旱的栽培條件下所誘發的乙烯回應(Ethylene responses)會減少玉米的穀粒產量，此時如果增強AGROS8基因的表現可以削弱乙烯所造成的不良作用，回復正常的穀粒產量。科學家利用CRISPR/Cas9技術在AGROS8基因的啟動子中塞入一段源自玉米的中強度啟動子GOS2，增強AGROS8基因的表現。經過編輯後的玉米在乾旱逆境下仍然能有接近正常的穀粒產量。 　　以CRISPR/Cas9為核心的基因編輯技術是一項強大的育種技術，在時效上大幅縮短傳統育種技術所需要的時間，在本質上編輯後的植物可以不含任何其他物種的核酸片段，在本質上無異於傳統育種所得的結果。因此美國農業部認為基因編輯作物不同於基因改造作物，不必受基因改造作物審查法規的管理。截止2017年底，美國農業部已經宣告不依基改作物法規審查的基因編輯作物計有抗褐化的蘑菇、改變澱粉組成的玉米穀粒、延遲開花時間的小米、抗旱耐鹽的黃豆等。這意味著研發基因編輯作物在時間和金錢的投報率上遠優於研發基因改造作物，因此中小型的農業生技公司或學術單位也可以放膽的投入基因編輯作物的研發行列。那歐盟對基因編輯作物的看法又是如何？歐盟對基改作物的認定標準不同於美國和加拿大，除了生物產品的本(Product-based)外，也會考量技術過程的本質(Process-based)，對於基因編輯植物的審核和管理是否要遵循基因改造作物的法規辦理仍無定論，反對和擁護基因編輯技術(產品)的兩方團體尚在激辯中。不過最近有一則新聞值得注意。歐盟法院(European Court of Justice)傾向於放寬基因編輯作物的管理。或許歐盟在不久的將來也會採取美國的作法，畢竟一昧地反對新穎性的科技可能會錯過競爭時機，犧牲了農產業的發展。有關基因編輯技術的應用開發和法規管理等事務值得我們持續關注。

柄海鞘(Styela clava)是一種棒狀大型海鞘，原生於太平洋海岸地區，由於其可抵禦溫度與鹽度的變動，且生長密度極高，因此容易在不同地區建立起新的族群，擠壓當地的原生物種生長所需的空間及食物，甚至捕食其他當地物種隻幼蟲。此外，柄海鞘具良好附著性，可能附著在船體或是水中儀器、捕魚設備上，使得業者需要耗費更多燃料、清潔與汰換成本，成為沿海養殖業者必須面對的問題。部分亞洲國家具有食用柄海鞘的習慣，能夠稍稍控制族群數量，但除了食用以外，若是可開發更加大量利用海鞘之用途，有助於提高此類入侵種所帶來的效益。 　　木漿是製造紙類與其他紙製品過程中所使用的原料之一，通常由商用木材加工後剩下的材料製成，然而木漿經過數次回收利用後纖維結構會愈加脆弱，故無法多次重複利用所造成的資源浪費也是一大難題。而美國國家標準與技術研究院（National Institute of Standards and Technology ，NIST）的研究人員現在將此兩種剩餘材料結合起來，形成一種新型複合材料，內部分子以螺旋形狀堆積，形成具有韌性的「Bouligand」結構；這種特殊結構在受力時能夠吸收與導出碰撞能量，同時保持材料的完整與功能性。【延伸閱讀】開發肯亞農民儲存農作收成的大型離網型冷藏庫 　　因為木材本身並無天然的Bouligand結構，經過多次酸清洗的木漿內含有纖維素奈米晶體，可經由加工製成具Bouligand結構之薄膜；但純木漿薄膜易碎且無法承受強大重量，這種同時結合動物與植物資源再利用之技術突破了木漿原有的性質，且增加了紫外線反射性。目前製造此種複合材療的成本仍然較高，需要審慎評估添加量與使用範圍；未來或許可應用於食品包裝、生物醫療設備、建築與機械結構上，增加受力與減緩光線損害物體之功能性。  　　此研究發表於<Advanced Functional Materials>

人類具有紅光、藍光、綠光等三色視覺受體，能夠區分這三種色光交疊合成的各種顏色；而蜜蜂複眼也具有三色視覺，包含藍光、綠光和紫外光等三種感光器，因此人眼與蜂眼所見的花朵顏色並不相同。而紫外光由於能量較高，能夠激發花朵上的螢光體而產生不同顏色的螢光，這些光線進入蜜蜂眼中的感光器，能夠幫助蜜蜂找到富含花蜜的地方。 　　雖然蜜蜂擁有三色視覺，但前人研究已證明其中一或兩種感光器能夠主導蜜蜂對花朵的偏好，尤其是藍色螢光光譜區段。由於目前尚無關於野生蜂的顏色偏好研究，故美國俄勒岡州立大學(Oregon State University，OSU)設計了一系列蜜蜂誘引裝置與結合日光激發產生螢光的裝置，用以測試野生蜂是否會受到綠色或藍色螢光的吸引，以及何種波長間的光線對野生蜂的誘引性更強。研究顯示，在不同的景觀背景的顏色條件下，野生蜂較偏好藍色螢光的誘導結果；此外，野生蜂在波長約400-490nm中藍色螢光區段更偏好波長介於430-490nm的螢光。【延伸閱讀】寄生黃蜂為種植者提供了無化學害蟲防治方法 　　相關結果發表於< Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology >。有鑑於蜂群數量日漸稀少，可能影響野生植物與作物的授粉與收獲，此研究具有未來評估與吸引蜂群的應用潛力，幫助科學家或農民誘引蜂群授粉。

歐盟前身為歐洲經濟共同體(European Economic Community)，是由西歐 6 國依 1958年羅馬條約而成立。1960年時歐體委員會正式提出建立共同農業政策(Common Agricultural Policy，CAP)，並於 1962 年逐步展開並實施，成為歐盟最重要的政策之一。為了因應歐洲公民需求和全球化挑戰，並長期確保歐洲食品安全、農產品安全和品質維持最高標準，CAP幾十年來面臨多次改革，相關法案方向也受到多方重視。【延伸閱讀】評估印度於綠色革命後穀物種植的永續性 　　CAP的2020年改革目標已在6月發布，未來CAP將走向更加現代化與簡化政策運作方式，鼓勵創新以提高農業與社會的附加價值，並透過一連串制衡措施確保各會員國履行對環境及氣候變化所需負擔的義務。最新的策略分為三個面向: 1. CAP將強調支持中小型家庭式農場，並鼓勵年輕人加入農業。適當補貼農民生產與勞動力成本，以增加農業競爭力，促進農村發展。 2. 由於農民與農業在因應氣候變化、環境保護、景觀和生物多樣性維護上扮演重要角色，因此CAP支持各會員國發展與支持有利於環境與氣候的農業策略，並要求其符合歐盟對各會員國所要求之環境義務。 3. CAP未來將持續鼓勵有利於農民與農村的研究與創新投資，幫助農民更有效的管理生產風險，幫助農民滿足大眾對農產品質、食品安全和健康的期望。歐盟地平線歐洲研究計劃(EU’s Horizon Europe research programme)將額外提供100億歐元用於支持特定研究以及糧食、農業、農村發展和生物經濟的創新。

2018年第十屆豬隻健康管理歐洲研討會(European Symposium on Porcine Health Management，ESPHM)在5/9-11於西班牙巴塞隆納舉行，其中有五項關於大數據於豬隻健康的商業應用。 1. 監測豬隻呼吸道狀況 　　比利時的Soundtalks公司擁有許多農場動物的音頻數據，透過麥克風收集、電腦判讀與智能預警系統協助管理者或獸醫判斷豬隻所發生呼吸促迫之狀況，目前正在美國進行大規模養豬場試驗，幫助發現豬隻早期的呼吸道疾病，未來持續將相關技術推廣到肉雞、蛋雞與牛群身上。 2. 測量與改善養豬場之生物安全性的電子追蹤系統 　　MSD Animal Health與PigChamp EU合作使用了B-eSecure，這是一個用於追蹤人員於不同農場間流動的電子系統，幫助了解人員移動狀況與豬繁殖和呼吸障礙綜合症(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)擴散間的關係，其測量結果可作為提升生物安全之參考，並可作為於培訓、指導和監督員工遵守生物安全規範之工具。 3. 新型豬疫苗接種裝置 　　Ceva公司展示了新一代Smartvac疫苗注射器，幫助簡化豬疫苗接種的程序，負責人能利用平板或智慧型手機上的應用程式追蹤疫苗注射速度、使用針頭數量、注射動物與操作者，所有資訊均使用簡明易懂的圖表顯現。Ceva還提供動物死後肺部評分分析，這些結果可與原始疫苗接種狀況連結。 　　Hipra公司則推出了Hipradermic無針疫苗接種裝置，此裝置可讀取疫苗瓶上的RFID晶片，得到疫苗資訊，包含藥品名稱、批號、保存期限等，還可透過藍芽與智慧型手機連接，用戶透過手機上的應用程式就能讀取疫苗接種時的相關數據。此外，Hipradermic還可經由HipraQnect系統進行管理，HipraQnect包含可讀取RFID天線、偵測疫苗接種輛的感測器及一張SIM卡，能夠自動且獨立將數據傳送至雲端保存。【延伸閱讀】開放式數據引領農業科技未來 　　MSD推出了IDAL®3G，這是IDAL系列最新的無針皮下注射裝置，採用長效鋰離子電池，能夠減輕豬隻與人在注射時的壓力，目前可配合該公司推出之PORCILIS® PRRS、PRIME PAC™ PRRS、PORCILIS® PCV ID、PORCILIS® M HYO ID ONCE、PORCILIS® AD BEGONIA等五種疫苗使用。

為了避免昆蟲啃食植株造成產量損失或傳播病害，慣行農法中會噴灑農藥驅趕或殺死農業害蟲，雖然能夠維持農作物產量，但卻因此減少其他無害甚至有利於植物授粉的昆蟲數量，例如蜜蜂。此外，殘留於環境中的合成藥劑可能因雨水沖刷而流入土讓或附近的湖泊、河川甚至海洋，影響該地區的生物多樣性，因此長期以來農藥的施用量與施用時機持續受到各方爭議。 　　考量環境永續與食安問題，越來越多人投入有機農業與研究減少農藥使用的方法；而煙草植物可自行於葉片中產生一種稱為cembratrienol的化學物質，防止害蟲靠近植株，因此德國慕尼黑技術大學(Technische Universität München，TUM)將相關的基因轉殖於大腸桿菌中，利用發酵槽大量產生cembratrienol，再使用離心分配層析(centrifugal partition chromatography，CPC)與高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)純化，透過實驗證實純化的產品具有良好的驅蚜蟲效果。 　　目前使用cembratrienol的定位類似於人體使用防蚊劑一般，將其噴灑於植株上只是利用害蟲對其氣味的忌避性，並無毒害昆蟲的疑慮，同時也具有生物降解性，減少累積於環境當中的風險。此外，在大腸桿菌生產過程中能夠使用輾穀廢料進行發酵，有助於循環使用農業副產物，建立對生態有利的下游加工選擇。而此研究使用CPC回收純化的方法更加節省溶劑的消耗，相關的純化方法或許可作為類似化合物純化回收的參考資訊。【延伸閱讀】研究發現糞金龜能改變土壤菌相組成有助於強化糧食安全 　　相關研究發表於<Green Chemistry>

隨著交通不斷革新，人們與貨物於各地間穿梭移動也越來越方便，部分物種可能因貿易、走私等人為攜帶，從原生地引入一個其先前未曾存在過的地區，並有能力克服當地環境限制而迅速擴展領地，以至於威脅到當地的生物多樣性成為「入侵種」，例如紅火蟻、小花蔓澤蘭、福壽螺等。比起顯而易見的大型植物或動物，入侵微生物於初期不易發現，所造成的危害往往更具破壞性。 　　最近美國加州沿海發現了一種新的入侵種- Phytophthora ramorum，此種微生物能侵入樹木維管束，使其水分運輸受阻，造成當地數十萬棵櫟屬樹種迅速萎凋死亡。目前推測P. ramorum可能原生自東南亞，透過感染症狀較輕微的植物寄主傳播到歐洲和北美地區，並成功在當地的原生林地蔓延，現在已可於許多苗圃與景觀植物上檢測出P. ramorum。除了通過法規限制州間植物交易以防止病害擴散，也應積極研究控制入侵病原體的方式。【延伸閱讀】最新研究發現可對抗克痢黴素抗藥性細菌之新興化合物 　　由於P. ramorum可產生厚膜孢子於土壤中長時間休眠，因此此次美國農業部採用木黴菌Trichoderma asperellum進行生物防治測試，於國家觀賞植物研究基地(National Ornamentals Research Site at Dominican，NORS-DUC)一系列的田間試驗中發現，T. asperellum可顯著降低土壤中P. ramorum的族群密度，目前作者Dr. Widmer已於生物農藥公司合作，踏出開發相關商業產品的第一步。 　　相關研究發表於<Biological Control>