永續農業的植物保健產品研發與應用

永續農業的植物保健產品研發與應用

國立中興大學植物病理學系 黃振文 終身特聘教授

國立中興大學循環經濟研究學院植物保健學程 黃姿碧教授

一、前言

 　　自1909年哈伯(Fritz Haber)發明人工合成氨的方法，化學肥料的研發及應用開始普及，也大幅提升了糧食的供應量，避免因世界人口急速增加，造成糧食危機。此外，自1940年代開始大量生產成本低廉的化學農藥，也變成農業生產的重要利器。雖然世界糧食產量大幅的提升，但由於長期大量使用化學農藥及化學肥料的負面效應也就逐漸浮現，例如: 大量施用DDT、BHC及含有重金屬之化學藥劑及化學肥料，嚴重傷害自然生態環境的平衡與人畜的健康，同時也造成土壤酸化，導致過量重金屬被植物吸收(楊，2004)；此外，也迫使土壤中多樣性的微生物逐漸單一化，喪失有效遏止病原菌為害植物的能力(Li et al., 2023)，進而降低作物生產力。因此為了維護農業環境資源永續，保護農作物健康，產官學界進行研發與應用友善環境的植物保健產品，已成為國內外栽培管理農作物的重要手段。

 　　研製生物製劑產品替代合成的化學肥料及化學農藥，以提升作物的生長與產量，是對抗環境逆境沖擊及保護作物健康的重要方法。我們曾利用稻穀、蔗渣、蚵殼粉、礦灰等農工廢棄物成功調製「SH土壤添加物」，用於改良土壤及防治多種農作物的土媒病害，成效相當卓著。SH土壤添加物的防治原理，除了改善土壤的理化性質外，也大量促進土中的微生物增殖，證明SH土壤添加物誘發產生的微生物，是參與抑制作物土媒病害發生的重要因子。

 　　因此我們團隊從2006年開始由台灣各地農田收集土壤與植物樣本，分離拮抗微生物菌種，依序在實驗室、溫室及田間進行測試分析，結果篩選出具有促進作物生長、防治作物病害及提升作物耐受非生物性逆境的多重功效之本土優良拮抗菌菌株，共計有Bacillus mycoides、B. subtilis、B. licheniformis及Streptomyces species等菌株。

　　我們利用工廠等級規模設備，將這些代表性的益生菌進行試量產製作成液態、粉狀及顆粒劑型的產品，除應用在農作物的保健外，並拓展單一微生物菌株製劑應用在畜禽及水產保健與環境污染復育等多種用途。此外，也利用植物病原菌Alternaria spp.菌絲體抽取的蛋白質，成功研發蛋白激活子製劑可以有效誘發植物產生抗病反應。本文主要目的在於分享我們由實驗室研究代表性微生物菌株的特性、功效與機理，拓展開發至商品化之植物保健產品及其於多元產業應用的經驗，以嚮讀者。

二、蕈狀芽孢桿菌(Bacillus mycoides)製劑產品

 　　蕈狀芽孢桿菌主要存活於農作物的根系、植體內部及土壤中，是一種本土的農作物保健益生菌，其於培養基上的菌落形態特殊，極易辨認(圖一) (彭及黃，2019)。本產品的菌種發酵配方及發酵製程，經過不斷的修正改良，製作成液劑、粉劑及導入栽培介質與種苗根系的技術均已相當成熟。

　　在實驗室、溫室及田間試驗結果，證明商品化的產品可顯著促進高麗菜、胡瓜、長豇豆、蘿蔔、萵苣、番茄、草莓及水稻等(圖一)作物根系與植株的生育及產量外，尚可有效防治番茄萎凋病、胡瓜與甘藍幼苗猝倒病、番茄與胡瓜白粉病、草莓萎凋病、水稻稻熱病、水稻白葉枯病、青蔥銹病及草莓紅蜘蛛等。西元2015年迄今，蕈狀芽孢桿菌 (BM02) 的技術授權廠商，在台灣各地陸續證明BM產品在田間可以有效防治苦瓜白粉病，咖啡銹病、蔬菜炭疽病及葉斑病，水稻白葉枯病、紋枯病及稻熱病，茄子青枯病、蝴蝶蘭黃葉病等病害的發生(圖二)，並大幅提高農作物的產量(Huang et al. 2022)。

圖一、蕈狀芽孢桿菌BM02的菌落型態及其產品於田間應用可促進水稻、草莓的生長及提升產量與品質。(引用自Huang et al. 2022)

圖二、蕈狀芽孢桿菌BM02產品防治番茄白粉病、蝴蝶蘭黃葉病及茄子青枯病的效果。(引用自Huang et al. 2022)

 　　探究B. mycoides BM02防治植物病害的相關機理，發現利用不同培養基培養B. mycoides，其所產生的氣體會抑制立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)菌絲生長，其中B. mycoides 生長於含有黃豆粉的培養基，其所產生的氣體最具有抑菌生長的功效。進一步利用氣相層析質譜儀分析B. mycoides產生的氣體，其產生的主要氣體為二硫二甲基(dimethyl disulfide)。利用空氣採樣器 (Gastec model GV-100 gas sampling pump; GASTEC Corporation, Japan)與氨氣檢知管(Color Detector Tube No.3La; GASTEC Corporation, Japan)檢測，發現B. mycoides 亦可產生氨氣。

　　應用電子顯微鏡觀察發現立枯絲核菌菌絲經過B. mycoides 產生二硫二甲基與氨氣處理之後，會使得菌絲尖端出現膨大與畸形的現象；也會使得猝倒病腐黴菌 (Pythium aphanidermatum)原生質凝聚、細胞壁變厚及細胞壁邊緣呈現不規則的情形。此外，二硫二甲基除了會使病原菌菌絲變形或細胞膜破裂外，亦會誘導植物產生抗性，抵抗病原菌的感染，進而達到防治作物病害的功效。

　　應用螢光基因轉殖技術證明B. mycoides 可以內生於植株的維管束及依附於根毛(圖三)。利用次世代定序分析接種過B. mycoides的草莓植體，發現可誘導啟動抗病和開花相關基因之表現，佐證B. mycoides 可以促進草莓提早開花，增加產量與抵抗萎凋病的發生。

圖三、蕈狀芽孢桿菌內生於植物體內，可促進植物生長，並可產生二硫二甲基誘導植株啟動抗病反應。(引用自GASE Newsletter – Taiwan Research Highlight. 2021.5)

三、枯草桿菌(Bacillus subtilis)及地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)製劑產品

 　　枯草桿菌與地衣芽孢桿菌，它們同歸屬為「枯草桿菌群」，也都具有產生耐受冷熱、乾旱、紫外線等環境逆境的內生孢子的能力，是美國食品藥物管理局 (US Food and Drug Administration)、歐洲食品安全局 (European Food Safety Authority) 及台灣農業部皆認可可作為農業、食品及飼料添加用的安全菌種 (黃及陳，2019)。我們團隊由台灣茶樹、番茄根部土壤、及菱角田中分別分離到本土枯草桿菌151B1菌株、枯草桿菌MCLB2菌株、枯草桿菌WMA1菌株及地衣芽孢桿菌EC34-01菌株，並建立工業化量產製程，以1500公升的微生物發酵量產槽產製之液劑菌量皆可達5×109 cfu/ml；也以噴霧乾燥機系統製備飼料加粉劑，所產製粉劑成品菌量可達5×1010 cfu/g以上。

　　我們開發微生物的生物農藥、生物肥料、生物刺激素及魚與豬飼料添加劑產品 (圖四)，皆已達產品上市規格。在研究室進行研究分析確認它們的作用機理外，也於田間及商業飼養場域進行功效驗證，證實發現此四株菌在植物保健、循環農業、畜禽及水產養殖均具有多元的應用潛力，可拓展應用於多種產業（圖四）。

　　我們團隊開發成功的B. subtilis 151B1液劑，也已經在符合世界經濟合作開發組織優良實驗室操作(Organization for Economic Cooperation and Development Good Laboratory Practice，OECD GLP)規範之毒理實驗室，完成口服及肺急毒性與致病性之安全性評估試驗，證實該液劑的安全性。

圖四、芽孢桿菌製劑產品可應用於植物保健、畜禽養殖及水產養殖之多元產業。

(引用自GASE Newsletter – Taiwan Research Highlight. 2021.5 及第二十屆國家新創獎)。

 　　我們研發的芽孢桿菌B. subtilis 151B1、B. subtilis MCLB2、B. subtilis WMA1及B. licheniformis E34-01可研製成生物肥料提供植物生長所需要之營養；依抑菌機理，製成生物農藥用於防治植物病害發生；亦可調製菌種擴培處方作為生物刺激素提升植物於逆境生長之韌性，用於保護農作物健康 (Chiang 2010; Hermanto 2019; Lin 2015; Sung 2020)。【延伸閱讀】- 到2025年化學農藥減量化行動方案

 　　此四株芽孢桿菌經實驗室、溫室及田間試驗證實具有促進草莓、白菜、甜椒、百香果及茶樹等多種植物生長，並提升產量與品質效果(Huang et al. 2022)。應用B. subtilis 151B1及B. licheniformis EC34-01於田間茶園應用，可分別提升金萱茶株單位平方公尺面積採收產量達307%及245% 。

　　將B. subtilis 151B1及B. licheniformis EC34-01製劑搭配以農業剩餘物高麗菜下位葉研製的CH100植物健素，應用於設施栽培小黃瓜，試驗結果顯示此兩芽孢桿菌單獨施用或搭配CH100植物健素之處理，皆能顯著提升小黃瓜品質及產量 (Huang et al. 2022)。這四菌株亦具有產生多種分解酵素的能力外，也有溶磷活性與產生吲哚乙酸等能力，可促進植物生長(圖五)；可登記作為溶磷微生物肥料，用於降低化學肥料之使用。

圖五、Bacillus subtilis 151B1具產生蛋白酶、澱粉酶、纖維素酶及脂解酶等多種酵素活性，並具溶磷活性與產生植物生長促進賀爾蒙吲哚乙酸之能力。

 　　這四株芽孢桿菌菌株在植物保健皆具有抑制多種植物病原菌生長的功效，可防治多種植物病害，各菌株各有其不同特性及適用作物對象。其中B. subtilis 151B1對真菌、卵菌病原及細菌病原，如:茶及百香果炭疽病、木瓜疫病及番茄青枯病等病原菌均具有拮抗效果，可用於防治百香果炭疽病、百香果頸腐病、瓜類萎凋病、瓜類苗期猝倒病、小黃瓜露菌病與茄科青枯病(Chen et al. 2020; Hseih 2018; Lin 2015)。B . subtilis MCLB2菌株應用於番茄之栽培管理，則可較對照組降低46.7%番茄細菌性青枯病的發生 (Hseih 2018)；B. subtilis WAM1 可應用於防治茄科疫病 (Nurman 2019)；B. licheniformis EC34-01則對白菜炭疽病原Colletotrichum higginsianum PA01、胡瓜炭疽病原Colletotrichum orbiculare COC3及十字花科黑斑病菌Alternaria brassicicola ABA31均具優異拮抗活性，可以使檬果炭疽病之罹病度由 100% 降至 10% ，具有良好防治病害的效果。

　　研究芽孢桿菌防治病害的原理，發現這些微生物製劑都具有多重的防病機制。其中較特別的是B. subtilis 151B1可產生C14, C15 family surfactins及C14, C15 family iturin A等二次代謝產物，抑制病原真菌孢子發芽，誘發病原真菌細胞凋亡，並影響病原真菌之呼吸作用及能量代謝 (圖六) (Chen et al. 2021; Huang et al. 2022)。

　　B . subtilis MCLB2則能夠纏據在植物的葉表及根系形成近似於膜狀的結構，此構造又被稱作是「生物膜」，並可產生抑制病原菌生長的物質，保護植物免於受病原菌的為害 (Hseih 2018)。將 B. licheniformis EC34-01 以 SSM (Soybean meal-Surimi-Molasses) 培養基培養之醱酵液粗萃取液以高效能液相層析 (HPLC) 收集獲得之活性化合物，經鑑定比對後確認可抑制炭疽病原菌之孢子發芽成分為金雀異黃酮素 (genistein; 5, 7, 4’ – trihydroxyisoflavone) (Chiang 2010; Huang et al. 2022)。此外，我們的研究亦證實B. subtilis 151B1及B. licheniformis EC34-01可誘發胡瓜PAL、POX及PR1a等植物防禦相關基因表現 (圖七)。

　　探討B. subtilis 151B1應用於田間百香果栽培對其根圈微生物相影響顯示，施用B. subtilis 151B1後，並不會影響根圈土壤中微生物物種之豐富度及多樣性，反而會改變原棲居微生物物種之組成，降低根圈Rhodanobacteraceae 及 Burkholderiaceae細菌、Fusarium spp.及Penicillium spp.等病原菌叢，增加芽孢桿菌科及乳酸菌科細菌及Trichoderma spp.族群量 (Huang et al. 2022; Huang et al. 2020)。綜合上述結果顯示，B. subtilis 151B1、WMA1、MCLB2菌株及B. licheniformis EC34-01具有防治多種作物病害的功效，可登記作為生物農藥。

圖六、Bacillus subtilis 151B1可影響病原真菌-百香果炭疽病菌之呼吸作用及能量代謝。左，阿爾瑪藍之細胞代謝活性測試 (Alamar Blue assay)；右，粒線體膜潛勢JC-1染色。

圖七、Bacillus subtilis 151B1 (BS) 及Bacillus licheniformis EC34-01 (BL) 具有防治作物病害的功效，並可誘發胡瓜PAL、POX及PR1a等植物防禦 (抗病) 相關基因表現。

 　　全球暖化引發的異常天氣發生頻率與日俱增，尤其乾旱及淹水等逆境對作物生產造成嚴重危害，因此我們也嘗試開發可提升作物耐乾旱及淹水等逆境之微生物製劑。研究發現B. licheniformis EC34-01及 B. subtilis WMA1菌株具優異生物膜產生能力，可纏據於作物葉表及根系 (圖四)，且能提升不結球白菜耐乾旱及淹水之能力，使不結球白菜在乾旱9天或淹水6天依然能存活，同時植株生育性狀亦較水或SYB養液對照組佳(圖四)。

　　研究亦證實B. subtilis WMA1菌株可提升不結球白菜對乾旱及淹水逆境之耐受性或可歸因其具有產生ACC deaminase的能力，且可提高不結球白菜植株之抗氧化酵素活性及降低逆境對光系統II造成損傷(Liu, 2023)。此外，我們也發現農業剩餘蔬果渣所調配之SYG培養基可作為促進B. subtilis WMA1生物膜及提升不結球白菜耐逆境能力之佐劑配方。本研究均已分別取得中華明國發明第I815533號及中華明國發明第I818611號專利。

 　　台灣每年有超過120萬公噸的農業廢棄物，除稻桿、稻殼、玉米桿、花生殼、大豆藤，還有蔬果廢棄物、菇類栽培介質、禽畜養殖廢棄物等，將此類廢棄物製作成堆肥再生循環利用，為兼具資源循環、環境保護與提升經濟的多贏方向。然而這些農業廢棄物多來自於慣行農法栽種，難免有化學農藥殘留，且廢棄物多為植株外層 (如甘藍外葉)，農藥種類及濃度相對較多且高，我們的檢測資料顯示，由農業廢棄資材所再製之堆肥中仍可檢出微量三賽唑、益達胺等農藥，因此我們評估B. subtilis 151B1及B. licheniformis EC34-01是否具農藥降解效果，結果發現B. subtilis 151B1及B. lcheniformis EC34-01皆具降解殺蟲劑馬拉松及第滅寧之效果；此外，B. subtilis 151B1亦具降解殺菌劑三賽唑效果(Huang et al. 2022) 。【延伸閱讀】- 利用農業廢棄物製造可生物降解的塑料

 　　B. subtilis及B. licheniformis為美國、歐盟認定為人類可食用且可添加於飼料之安全菌種，且為台灣農業部公告可供家畜、家禽、水產動物之飼料添加物。我們發現將B. subtilis 151B1加入豬飼料中，分別可以提升豬隻的體重，使肉豬提早3天達到上市之體重，且肉質鮮紅、軟嫩多汁、減少豬糞便臭味來源之硫化氫及硫醇含量、改善豬場環境 (圖四) (Huang et al. 2022)。將B. subtilis 151B1餵食肉雞，亦可提升雞胸肉及腿肉於整體肌肉重之比例，並可提升IgA及IgG等免疫指標，另亦發現餵食B. subtilis 151B1之肉雞墊料中的氨氣含量較低於市面上販售含預防性藥物飼料添加物的組別。且可降低由Clostridium perfringens所造成壞死性腸炎，並讓餵食添加B. subtilis 151B1飼料，在肉雞受C. perfringens感染後之腸道膜，仍維持如健康肉雞之腸道膜完整性 (圖八)。

圖八、添加Bacillus subtilis 151B1及Bacillus licheniformis EC34-01可降低由Clostridium perfringens所造成壞死性腸炎 (左) 及維繫受C. perfringens感染後之腸道完整性 (右)。Control:未接種病原對照組；C：接種C. perfringens (2 × 108 CFU/mL)；BS：餵食B. subtilis151B1；BL：餵食B. licheniformis EC34-01；Kemin：餵食B. subtilis市售商品Kemin CLOSTAT®。

 　　將B. subtilis 151B1及B. licheniformis E34-01等益生菌，分別加入虱目魚、吳郭魚及白蝦飼料養殖時，也可增進魚及白蝦肥滿度 (圖四及圖九)、降低魚及白蝦疾病發生率以及改善魚蝦養殖池水質。另外也証實該菌種可增加魚的腸道益菌菌叢，減少腸道弧菌目 (Vibrionales) 病原，並可改善養殖水質，調整養殖水體中藻類餌料的生物相及改變魚腸道菌相等多重水產養殖應用功效 (圖九) (Huang et al. 2022)。

圖九、Bacillus subtilis 151B1 (BS) 及 Bacillus licheniformis EC34-01 (BL) 作為魚飼料添加劑能增進魚的飽滿度，提高取肉率，提升飼料效率，並能有效降低腸道弧菌菌叢及增加養殖水體中藻類餌料。

 　　我們所研發芽孢桿菌於農作物、畜禽水產多元應用技術，自2020年起技術授權兩家生技公司。廠商開發出多項可對抗氣候環境變遷之農業栽培管理應用產品，搭配該公司奈米鈣及矽等資材，應用於九層塔、檬果、蓮霧、百香果、甜瓜、草莓、茶葉與柑橘生產，能有效提升作物耐受乾旱與淹水等環境逆境，並可使水稻能抗倒伏(圖十)，亦可提升作物品質、產量與安全，顯著提升農民收益且兼顧環境資源永續。

　　此外，我們也發現技術授權枯草桿菌151B1菌株搭配禽畜糞堆肥，應用於水稻栽培，依黃金標準(Gold Standard for Global Goals)的土壤有機碳框架方法學 (Soil Organic Carbon Framework Methodology) 建議之方法進行採樣，並經土壤有機碳檢測結果顯示，田區經處理含有枯草桿菌151B1菌株之禽畜糞堆肥，除可增加水稻收成產量外，換算每公頃試驗田區下層土壤可增加66.495噸二氧化碳，符合COP21巴黎氣候峰會中所提出之「千分之四倡議」，有效增加土壤固碳效益。【延伸閱讀】- 農田減排、增固碳、增碳匯的科學管理

圖十 、應用Bacillus subtilis MCLB2產品可使水稻抗倒伏，並提升百香果的著果率、品質及產量。

四、稠李鏈黴菌(Streptomyces padanus PMS-702)製劑產品

 　　Streptomyces padanus PMS-702是從台灣農田堆肥中分離獲得，經與Acremonium diospyri、Colletotrichum gloeosporioides、Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans、F. oxysporum f. sp. niveum、F. oxysporum f. sp. lactucae、F. oxysporum f. sp. raphani、F. proliferatum、Pestalotiopsis eriobotryfolia、Pythium myriotylum、P. aphanideratum、Rhizoctonia solani等11種植物病原真菌進行對峙培養測定，證明PMS-702菌株具有優異的拮抗能力。進一步，取PMS-702再與其他20種植物病原真菌與9種植物病原細菌進行對峙培養測定，結果顯示PMS-702對於各種植物病原真菌具有不同程度的拮抗功效。

　　利用傳統鑑定方法發現PMS-702菌體的細胞壁含L-二氨基庚二酸(L-diaminopimelic acid; L-DAP)，全細胞中不含特殊糖類，屬於Chemotype IC型，是Streptomyces 屬內的一個種。它在ISP2 (International Streptomyces Project Medium 2), ISP3及ISP4培養基上生長及產孢情形良好，在ISP2及ISP4培養基上可以產生黃色色素，但不產生黑色素；其營養菌絲呈灰黃色至橘黃色；氣生菌絲為灰黃褐色或淺灰色。

　　在掃描式電子顯微鏡觀察PMS-702菌株，發現孢子鏈生呈螺旋狀排列，每串孢子數目超過20個，表面平滑。PMS-702菌株可利用的醣類有：D-glucose, D-fructose, D-xylose, D-mannitol, cellulose；可分解starch, casein, 及hypoxanthine。將PMS-702菌株之形態、生理、生化特徵及16S rRNA全長度基因序列分別與S. galbus CCRC12166及S. padanus CCRC12168等菌株的特性比對後，鑑定PMS-702菌株為Streptomyces padanus Baldacci. et al.。

 　　為了有效利用Streptomyces padanus PMS-702防治植物病害，需要探討PMS-702菌株與不同營養資材間的親和性，因此我們針對6種不同營養配方比較它們培養PMS-702菌株的效果差異，結果顯示以SMG配方培養PMS-702之生質量最佳。進一步，選香蕉黃葉病菌評估PMS-702在不同配方組合中的抑菌功效，結果顯示SMG配方培養PMS-702經過7天或14天的濾液，對於黃葉病菌孢子的抗生活性最佳，因此選用SMG配方培養PMS-702研製植物保護製劑產品。

　　在實驗室內取植株或切離葉檢定分析法PMS-702植保製劑的防病功效，證實S. padanus PMS-702製劑可以抑制Acremonium lactucum、Colletotrichum gloeosporioides、Peronospora brassicae、Microdochium panattonianum、Phytophthora citrophthora等植物病原菌。隨後在新社種苗繁殖場田間測試PMS-702製劑防治番茄晚疫病 (Phytophthora infestans) 的效果，結果顯示PMS-702製劑確實可以有效防治番茄晚疫病；並可提高番茄的果實產量。技轉合作廠商台灣肥料公司在宜蘭田間試驗，也証實PMS-702可有效防治蔥疫病。

 　　PMS-702菌株培養濾液的系列萃取的抽出物對於植物病原真菌亦具有抗菌活性，因此利用分光光度計及薄層色層分析PMS-702的培養濾液，發現其含有多烯類大環內脂（polyene macrolide） 的抑菌物質。S. padanus PMS-702之培養濾液經由矽膠管柱層析（Silica Gel Chromatography）分離，再以不同比例溶劑萃取，分別得到PM-1~PM-4等4個沖提區。進一步，以薄層色層分析與矽膠管柱層析分離純化後，可由此4沖提區分別純化出具有抑菌活性的化合物。利用紫外光吸收光譜、紅外線光譜、核磁共振光譜及質譜儀等之相關圖譜資料分析，將此化合物鑑定為治黴色基素 (Fungichromin)。Fungichromin是PMS-702濾液抑制R. solani的主要抗菌物質。利用掃瞄式電子顯微鏡觀察處理過S. padanus PMS-702培養濾液的立枯絲核菌菌絲，會出現破裂及壞死的現象。這些現象顯示S. padanus分泌的抗生物質fungichromin與R. solani菌絲遭受破壞有著密切的關係(Shih et al., 2003)。

 　　此外，我們發現治黴色基素3.07mg/L的劑量可顯著抑制50%以上的水稻紋枯病菌菌絲生長，並可引起菌絲原生質滲漏及抑制病原菌形成侵入墊(infection cusions)的構造。在混有紋枯病菌的稻稈田土中施用0.5 % (v/v) PMS-702發酵液，可加速病原菌死亡及減少病原菌於稻稈中的存活。進一步，研究發現PMS-702發酵液配合0.5 % (w/v)苦茶粕施用後第12天，可使土壤中帶菌稻稈之菌絲完全死亡，施用三週後亦可顯著降低紋枯病菌核發芽率。此外，利用黃豆粉-葡萄糖培養液(SMGC-2)培養S. padanus PMS-702製成SMGC-2發酵液與2 % (w/v)茶皂素溶液以體積一比一混合製成SPT製劑後，在溫室進行水稻紋枯病的防治試驗，結果發現SPT製劑之100倍稀釋液可使水稻紋枯病的罹病度由66.67 %降至24.04 %。

　　這些研究成果證明稠李鏈黴菌PMS-702之發酵液搭配苦茶粕拌入稻田中，可有效降低紋枯病菌於稻稈上存活外，其發酵液混合2 %茶皂素溶液，亦可顯著防治水稻紋枯病的發生 (Yang et al., 2021)。

五、利用基因轉殖技術生產微生物抗病蛋白(又稱: 蛋白激活子製劑)

 　　植物的防禦系統可以透過生物和非生物因子誘發產生。我們從植物病原微生物純化獲得的總蛋白質，雖不會抑制真菌的生長，也不會引發受測試植物的過敏反應，但卻可促進植物生長及降低病害發生的嚴重度，這種現象會隨供試蛋白質和不同植物種類而有所差異。

 　　我們團隊從植物病原菌Alternaria brassicicola及Sclerotium rolfsii菌絲體中抽取的蛋白質，具有促進甘藍、番茄及甜椒等蔬菜幼苗生長的效果，但對於西瓜及胡瓜幼苗之生長則較無明顯的作用。此外在病害防治方面，則以A. alternata之蛋白質防治甘藍黑斑病及白菜炭疽病的效果最為顯著，至於A. brassicicola 及Colletotrichum higginsianum兩者之蛋白質則具有防治胡瓜白粉病之效果。進一步，測試蛋白質之稀釋液對病原真菌之菌絲生長是否亦具有拮抗作用，結果顯示測試的真菌蛋白質皆不具有抑菌之功效，因此研判真菌總蛋白可以有效防治蔬菜病害的原理可能與其誘導植體的抗病反應有關。

 　　評估Alternaria brassicicola (ABA) 及A. alternata (ALA) 真菌蛋白質誘導植物抗病功效，結果顯示甜椒幼苗處理ABA之總蛋白質1000倍稀釋液可降低立枯病發生率達12%，白菜幼苗處理ABA之總蛋白質1000 倍稀釋液亦可顯著降低立枯病發生達60%；白菜葉片處理ABA 及ALA之總蛋白質1000 倍稀釋液分別可減少白菜炭疽病發生達25%與30%；胡瓜葉片處理ABA 及ALA 之總蛋白質1000倍稀釋液則分別減少胡瓜炭疽病發生達60%與52%。上述試驗，皆以總蛋白質稀釋1000 倍施用。進一步測試不同濃度之蛋白質稀釋液對於胡瓜炭疽病發生的影響，結果顯示相同濃度之ABA及ALA蛋白質稀釋液對於減輕胡瓜炭疽病之發生率，以ALA蛋白質稀釋液的效果較佳。

　　因此，進一步將不同濃度之ALA 蛋白質稀釋液處理胡瓜葉片並接種胡瓜炭疽病菌，結果顯示處理2µg/ml 濃度之蛋白質稀釋液的效果最佳，可減少胡瓜炭疽病發生達70%左右。胡瓜葉片處理ALA 蛋白質1000 倍稀釋液(2µg/ mL) 經過0小時及24小時後，分別接種胡瓜炭疽病菌之分生孢子懸浮液(2×104spores/ mL)，結果顯示蛋白質稀釋液於兩種不同時間處理皆可顯著減少病害的發生。測試真菌蛋白質對白菜抗病相關酵素活性的影響，將白菜葉片處理植物病原菌之總蛋白質後接種立枯病菌之菌絲塊，並觀察白菜葉片上病斑擴展的情形，藉以篩選具有生物活性之蛋白質，結果顯示施用A. tenuissima (APR01) 之總蛋白質稀釋液(2µg/ mL) 可有效減緩立枯絲核菌在白菜葉片上擴展，亦可有效降低白菜幼苗立枯病的發生。

　　白菜的葉片處理過植物病原真菌的總蛋白體後，分析白菜的抗病相關酵素如PAL (phenylalanine ammonialyase)與POD (peroxidase)的活性，結果發現處理植物病原真菌的總蛋白質並接種立枯絲核菌(Rhizoctonia solani AG-4 RST-04)的白菜，其PAL及POD等酵素的活性均明顯的增加，顯示植物病原真菌蛋白質中含有可誘導白菜抗病的因子。

 　　利用SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 電泳分析植物病原真菌的總蛋白質，並以Coomassie Brilliant BlCueR-250 (CBR)染色後，在電泳膠片上可呈現條帶。若將其以50℃熱處理時，即會喪失防病的功效，顯示其活性成分，屬於一種蛋白質。進一步，利用不同的分子篩過濾，發現分子量在10 KDa以下的組成分，不具有防病的功效，推測該有效成分物的分子量大於10 KDa。隨後將該蛋白基因轉殖於大腸桿菌進行大量表現重組蛋白，並評估其誘導胡瓜抗炭疽病的效果，分別將未轉殖之E. coli BL21 (blank)、轉殖pET-28a載體之E. coli BL21(check)、轉殖ALA 片段的ALA-01、轉殖含有APR片段的APR-09 及APR-16 等重組蛋白的粗萃取液(2 μg/mL)，分別噴佈胡瓜葉片上，觀察各蛋白之粗萃液對炭疽病發生的影響。結果發現APR-09 及APR-16 之重組蛋白粗萃液可分別減少胡瓜炭疽病發生達73%與72% (圖十一)。

　　然而，ALA-01之蛋白粗萃液並無法有效地減少胡瓜炭疽病發生，其原因有可能歸因於大腸桿菌細胞內易形成內含體 (inclusion body)，致無法獲得有活性的重組蛋白，亦或是超音波粉碎細胞的條件未能充分地將ALA-01 的重組蛋白釋出或破壞其結構，使其喪失誘導抗病的功能。進一步以SDS-PAGE 分析蛋白質時，透過蛋白質誘導表現試驗，ALA-01 可出現34kDa-42kDa的條帶，若以His-trapTM column純化蛋白粗萃液並濃縮目標蛋白，即可得到純度90%以上的蛋白質；再利用2μg/mL ALA-01及APR-09 蛋白質分別施用於胡瓜葉片上，可誘導胡瓜抗炭疽病的效果分別可達55%及34%。

圖十一、重組蛋白 (APR-09) 之粗萃取液誘導胡瓜抗炭疽病的效果。

六、微生物植物保健產品研發與展望

 　　微生物有多元的功能及用途，但微生物製劑產品的研發，常受限於研發人員的專長，而限縮了製劑產品應用領域的開發，以及所開發產品可拓展的市場。另外，也常因為儀器設備的限制，產品研製無法達到產業量產的規模，並建立量產標準流程，使相關技術在移轉後業界仍須自行克服量產及產品應用的瓶頸，而導致研發成果與商品間應用效用的落差及延宕商品化時程。

　　本文以我們跨領域團隊共同合作開發，從實驗室研發到田間試驗及商品化的經驗與讀者分享。「一個人的力量有限，分享才能發揮更大的價值」，大家彼此貢獻自己的專長與經驗，資源及研發成果共享，便能縮短研發時程，讓微生物發揮「一菌多效」，不僅可用於作物健康保健，又能跨足禽畜、水產養殖領域，擴大保護範圍，讓更多產業受益。

　　而研發成果技術移轉產業界後，研發人員亦為技轉業者與產品使用者間重要橋樑，因研發人員了解微生物製劑產品主要機理與應用最適時機及方式，若能與技轉業者持續合作，至田間共同推廣教育使用者，就能讓產品發揮最大效用，加速落實產品在田間之應用。

 　　我們所研發的孢桿菌屬益菌（蕈狀芽孢桿菌、枯草桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌）、稠李鏈黴菌及蛋白激活子植物保健產品，可作為生物農藥、生物肥料及生物刺激素，為糧食生產安全與農業環境永續提供了解決方案。我們並成功將單一微生物菌種，讓它可跨足至植物保健、畜禽產業與水產養殖。

 　　應用於作物栽培可提升作物品質及產量，降低病害、乾旱淹水逆境之傷害，減少化學農藥及化學肥料和抗生素的使用，亦可降解堆肥中的農藥殘留，促使農業廢棄物製成的堆肥更安全。添加至豬雞魚蝦飼料中，有助於促進畜禽水產動物生長、減少抗生素使用、增強免疫力與改善飼養場域環境，使能同時兼顧動物、植物和環境健康的防護，開創微生物製劑產品多元產業應用新價值。研發技術成品除於實際產業場域進行功效驗證，亦需進行學理機轉之探討，作為技術專利保護基礎，以使產品能推展至國際市場。

　　相關技術成果已授權廠商量產，落實產業應用，並嘉惠農民助益產業。也期冀所研發之微生物製劑相關技術與應用，能讓這片大地生機再現，資源循環永續。

 

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黃振文教授、黃姿碧教授
國立中興大學植物病理學系、國立中興大學循環經濟研究學院植物保健學程